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高光譜成像技術實現馬鈴薯葉片葉綠素及病害聯合檢測

一、馬鈴薯葉片的特征參數選取與葉綠素測定 

高光譜圖像中包含了豐富的光譜信息和圖像信息，相較于多光譜，高光譜成像中波段的增加使對物質的特性描述更加準確，可為研究人員提供足夠量的數據用于物質的分類識別和預測。然而，信息量的增加必然會導致信息冗余，增加數處理分析的復雜性和難度。如果只研究目標物體中某一物質的特性或含量多少，用全波段光譜數據顯然會加大其中的工作量，使研究意義降低。 

因此，需要用到特征參數提取的方法用以去除全波段n個數據中與被研究目標無關的高光譜數據，選取能夠準確反映被研究目標特性的m個光譜數據，這m個數據即為該研究對象的高光譜特征參數。目前，光譜特征參數選取的方式主要分為兩種： 

（1）光譜特征選擇，即針對被研究對象，選擇全波段光譜中的某些波段的光譜數據作為被研究對象的特征參數。這些波段包括了該物體的主要特征光譜，并且能夠最大程度地與其他物體區別開來。光譜求導，相關系數法、連續投影算法等方法都屬于該特征參數提取方式。光譜特征選擇過程如圖3.1所示。

（2）光譜特征提取，它是基于各波段光譜重新組合優化提取研究對象特征參數的過程，其目的與光譜特征選擇一致。主成分分析（PCA）、植被指數計算等方法都屬于該范疇之內。圖3.2是光譜特征提取流程。 

二、高光譜圖像的采集與掩膜處理 

使用高光譜分選儀采集到的馬鈴薯葉片圖像，在未經過任何處理之前，其中只含有葉片的光譜響應值數據。若使用葉片的光譜反射率數據進行研究，則必需首先對圖像做反射率校正，光譜響應值在校正后轉化為光譜反射率，并能初步緩解采集過程中噪聲對整幅圖片的影響。圖像校正后需使用掩膜屏蔽其中的背景信息，只保留葉片的光譜信息，保證原始光譜數據準確性，便于展開后續研究工作。

1.研究對象 

本文以馬鈴薯葉片為研究對象，研究所用樣本葉片均摘自云南師范大學生命科學學院的馬鈴薯試驗種植基地，采摘時間為2019年秋季，總計得到80個可用樣本葉片。為保證研究結果的準確性，所用樣本葉片隨機摘自試驗基地內生長狀況良好、健康、無病害侵染的不同馬鈴薯植株。選擇總樣本數量的75%，即60個樣本葉片作為訓練集，剩余樣本作預測集使用。摘得的馬鈴薯樣本葉片將用于本章的高光譜圖像采集、葉綠素測定、光譜預處理和特征參數提取以及后續章節的葉綠素反演模型的建立。 

2.馬鈴薯葉片的高光譜圖像采集與反射率校正 

使用高光譜分選儀于暗室環境中（盡量去除環境光對圖像采集的影響）采集樣本葉片的高光譜圖像數據。所用的分選儀與高光譜相機參數已由上述表給出。在本文使用256波段的采集模式來獲取馬鈴薯葉片高光譜圖像數據。 分選儀開預熱并進行高光譜采集工作。圖3.3（a）是采集的部分樣本葉片的高光譜圖像，右邊黃色區域為光源照明下的標準白板；隨機取圖像中7點位置，其光譜響應值（DN值）曲線如圖 3.3（b）所示，由于噪聲影響（儀器噪聲、環境噪聲等），在響應值曲線中出現許多因噪聲導致的毛刺。必須對原始圖像進行反射率校正和計算，獲得較為準確的葉片的光譜反射率數據，具體方法是：

控制電位移平臺移動，將標準白板對準高光譜相機鏡頭，采集標準白板的光譜響應值，作為白幀 W；蓋上鏡頭蓋，關閉鹵素燈，采集無光條件下的光譜響應值，記為黑幀 D。設原始高光譜圖像的響應值為 R(DN)，根據公式（3.1） 

計算出校正后的光譜響應值 R′(DN)。再通過數據歸一化，得到校正后的光譜反射率，經計算機輸出一幅含有物體反射率信息的高光譜圖像。圖 3.4（a）則是反射率校正后的馬鈴薯葉片高光譜圖像，對比圖 3.3（a），從視覺能看出圖中標準白板區域已校正為原有的白色，圖 3.4（b）是葉片上7處位置與標準白板上1點位置對應的光譜反射率曲線，可以看出，校正后曲線上的噪聲毛刺被去除，光譜反射率歸一化到0-1之間，黑色曲線對應標準白板的反射率，其反射率接近于1或者100%。 

3.圖像掩膜 

掩膜是圖像處理中常用的一種方法，它的實現過程是選定一張圖像或圖形，對待處理的圖像進行遮擋，提取出遮擋或者是未遮擋部分圖像。用于遮擋的圖像或圖形被稱為模板或掩模，在光學圖像處理中，掩?？梢允悄z片、濾光片、遮光板等，數字圖像處理中，掩模為二維矩陣數組，有時也用多值圖像[46]。在處理高光譜圖像時，掩膜主要用于以下幾個方面[47]： 

（1）感興趣區域提取，將事先手動繪制好的感興趣區作為模板，與待處理圖像進行乘法運算，得到感興趣區圖像，在感興趣區內的圖像信息與原圖像一致，區域外的圖像信號值則變為0； 

（2）起屏蔽作用，用模板圖像屏蔽待處理圖像中的某個區域，使該區域中所有的圖像信息不參與后續的圖像數據處理，或僅對屏蔽區內的圖像進行統計或處理； 

（3）提取結構特征，由于模板圖像具有一定的結構特征，可以將模板的結構特征與待處理圖像結構特征做對比運算，從待測圖像中提取與模板結構特征相近似的區域用做進一步處理分析。 

（4）制作特殊形狀的圖像，其原理與提取感興趣區域一致，是裁剪圖像的一種方式。

根據圖3.4（a），經反射率校正的高光譜圖像還包含有背景信息（黑色的電位移平臺），對該圖像進行數據處理時，背景信息會對馬鈴薯葉片信息產生一定的影響，降低其數據可靠性，因此，使用掩膜中感興趣區提取的方法對高光譜圖像進行處理，去除圖像中的背景信息，只保留馬鈴薯葉片區域的光譜信息，便于后續的光譜預處理、特征參數選取以及建模等工作的開展。 使用ENVI5.1軟件對馬鈴薯葉片高光譜圖像做掩膜處理，先提取馬鈴薯葉片部位的感興趣區，再將區域外背景值設置為0，屏蔽掉背景信息。掩膜結果見圖3.5，（a）圖是反射率校正的馬鈴薯葉片高光譜圖像，紅線區域內為手動劃分的感興趣區，（b）圖是掩膜后的馬鈴薯葉片圖像，可以看出，葉片上的黃色、黑色病變斑點在掩膜后的圖像中能更加清楚的分辨出來。 

圖3.6為80個馬鈴薯樣本葉片的高光譜圖像在經過反射率校正與掩膜處理，提取的葉片平均光譜反射率曲線。 

三、馬鈴薯葉片葉綠素含量測定 

目前，葉綠素含量測定方法主要有熒光分析法、活體葉綠素儀法、分光光度法和高效液相色譜法。前三種測量方法大都利用葉綠素的光學特性來確定其含量多少，高效液相色譜法則是利用葉綠素的層析色譜原理，實現葉綠素的定量檢測。本節就這幾種主要的葉綠素測定方法做簡要介紹，并利用分光光度法，測定實驗所用樣本葉片的葉綠素含量。 

1.常用葉綠素測定方法簡介 

熒光分析法利用了葉綠素的熒光特性，葉綠素分子被紫外光照射后可發射出紅色熒光，其熒光強度與葉綠素濃度呈正比，據此可采用熒光法進行葉綠素a的定量分析[48]。先使用熒光光度計測定不同濃度梯度的葉綠素標準提取液（一般為丙酮溶液）中葉綠素熒光值，繪制葉綠素熒光工作曲線，如圖3.7所示，對該曲線進行回歸，得出回歸方程[49]；之后測得待定樣本的葉綠素熒光值，代入上述回歸方程計算得到相應的葉綠素濃度，再將濃度值代入相關葉綠素含量計算公式得出葉綠素含量。該方法最主要特點是靈敏度高，對葉綠素檢測能力達到ug/L的級別，常用于水體等葉綠素含量不明顯物質的檢測，其缺點是操作繁瑣，測定效率相對較低。

活體葉綠素儀法主要是使用葉綠素儀對植物葉片進行葉綠素檢測，其基本工作原理是葉綠素儀通過發射兩束不同波長的光束透過葉片，在光線接收端測定兩種波長光束的透光系數，用以確定葉片當前葉綠素含量相對值，即葉綠素SPAD值。下圖是目前常用的便攜式葉綠素儀，可實時監測植物葉片的葉綠素含量，但是缺點也較為明顯，從圖中可以看出，葉綠素儀一次只能測量葉片中某點位置的葉綠素值，需多次測量才能反映該葉片葉綠素含量情況，易受人為主觀因素影響，其測量精度相對偏低。 

分光光度法與熒光分析法原理類似，利用葉綠素對光的選擇吸收性，使用可見光分光光度計測得葉片葉綠素提取液（80%丙酮溶液或95%乙醇制?。┰谔囟úㄩL下（645nm、652nm或663nm，常用652nm）的光吸收度，代入葉綠素計算公式即可得出待測樣本的葉綠素含量。分光光度法是目前測定葉綠素的最常見方法，該方法測定過程相對簡單，結果準確；其麻煩之處在于葉綠素提取液的制備，制備過程漫長，平均制備一個樣本的葉綠素提取液需要20-30分鐘。 

高效液相色譜法是測定葉綠素含量的另一種較為常用的方法。它的工作原理較為復雜，在此只進行簡要概述。高效液相色譜法是基于色譜法，以含有成分的待測液體為流動相，采用高壓泵系統，將流動相泵入裝有固定相（固定相用于分離流動相中各個色素）的色譜柱內，當經過色譜柱的葉綠素被分離后，送入檢測器內進行檢測，實現對待測樣本的葉綠素含量測定。高效液相色譜法有高速、高效的特點，它分析速度快，對待測樣分離效能高，廣泛用于有機化合物的分析中，也是葉綠素測定的方法之一，缺點是對流動相的流型要求較高，任何測定過程中的流型改變都會影響色譜峰加寬，導致其柱效率降低，進而影響測量速度與精度。 

2.本文所用葉綠素測定方法 

本文采用分光光度法測定馬鈴薯葉片的葉綠素含量，每批次馬鈴薯樣本葉片的高光譜圖像采集完成后，需立即將葉片送至生物實驗室對其測定。具體操作過程如下： 

（1）用電子天平稱取一片馬鈴薯葉片的重量，記為mg。 

（2）將葉片剪碎置于研缽中，加入少量經滅菌后的石英砂和碳酸鈣粉末以及體積分數為95%的酒精，將其研磨至葉片組織變白（一般研磨3-5min），再加入適量的酒精將其研成勻漿，于室溫暗處靜置10到15分鐘，等待葉片中的葉綠素充分溶解到酒精溶液中。 

（3）使用濾紙和玻璃漏斗把勻漿過濾到25mL 容量瓶中。用滴管吸取酒精溶液洗凈研缽，清洗液也全部過濾至容量瓶中，繼續用酒精清洗吸附在濾紙上的葉綠素，待濾紙與殘渣全部變白后定容至25mL，制得該樣本葉片的葉綠素提取液。 

（4）使用分光光度計測得葉綠素提取液在波長為652nm處的吸光度，記為A652，利用公式（3.2） 

計算提取液中葉綠素總質量濃度c（單位: mg/L），其中34.5是葉綠素在光波長652nm處的吸光系數，不同波長下的葉綠素吸光系數不同。通過公式（3.3） 

得出該樣本葉片的葉綠素質量分數ω（單位：mg/g），也就是葉綠素含量。式中V為葉綠素提取液體積，本文中V取25mL。圖3.9是葉綠素測定過程中所用的主要材料、儀器與設備，包括石英砂和碳酸鈣粉末（已滅菌）、95%體積分數的酒精、電子天平（精確到0.001g）、分光光度計檢測系統；葉綠素測定實驗在生命科學學院的生物實驗室中完成。 

所有樣本葉片的葉綠素含量統計情況見圖3.10，圖3.10（a）是所有樣本葉片的葉綠素含量測定統計值，從該圖能粗略的看出，樣本葉片葉綠素含量分布在0.8-1.5mg/g 的范圍內。（b）圖是劃分了訓練集與預測集的葉綠素統計圖，標記了葉綠素的最小值、最大值、平均值與標準偏差，從最小值與最大值可以總結出，訓練集樣本葉片的葉綠素含量分布范圍是0.912-1.383mg/g，預測集樣本葉片的葉綠素含量分布為0.950-1.427mg/g；訓練集葉綠素含量平均值為 1.114mg/g，標準偏差是 0.122mg/g；預測集葉片的葉綠素平均值則1.151mg/g，標準偏差為0.123mg/g。